Virus Seoul adalah satu satu dari empat spesies Hantavirus penyebab Haemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS). Virus Seoul merupakan virus RNA negatif rantai tunggal, terdiri dari tiga segmen gen yaitu S, M, dan L. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi segmen L virus Seoul dari R. norvegicus asal Semarang. Diharapkan isolat virus yang telah terkarakterisasi dapat dijadikan sebagai bahan biologik, baik untuk pengembangan vaksin maupun untuk bahan diagnostik. Sampel penelitian yang digunakan adalah RNA virus Seoul yang diisolasi dari jaringan paru R. norvegicus asal Semarang. Amplifikasi segmen L virus Seoul dilakukan dengan nested-PCR. Analisis menggunakan data pembanding dari GenBank. Pohon filogenetik disusun menggunakan program Mega 6. Hasil penelitian menunjukkan homologi antara virus Seoul asal Semarang dengan sekuen asal GenBank ditingkat nukleotida berkisar antara 93.1 – 97.1% dan ditingkat asam amino 98,1 – 100%. Homologi tertinggi ditingkat nukleotida (97,1%) dengan sekuen virus Seoul asal Perancis. Hasil analisis filogenetik menunjukkan Virus Seoul asal Semarang lebih dekat dengan virus Seoul asal Perancis dan Jakarta. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa karakter segmen L virus Seoul asal Semarang mempunyai lebih banyak kesamaan dengan virus Seoul asal Perancis dan Jakarta.